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实验五 聚合酶链式反应（PCR）
一、实验原理
聚合酶链式反应（PoLymerase chain reaction, PCR）是一项体外特异扩增特定DNA片断的核酸合成手艺 ，这项手艺是分子生物学研究领域的一次创举 。
PCR通常需要两个位于待扩增片断两侧的寡聚核苷酸引物 ，这些引物划分与待扩增片断的两条链互补并定向 ，使两引物之间的区域得以通过聚合酶而扩增 。反应历程为首先必需使得待扩增DNA（称为模板）置于高温下解链成单链模板 ，这一历程叫变性；第二步为划分与待扩增的DNA片断两条链的3’端互补的人工合成的寡聚核苷酸引物（Primer 15-20bp）在低温条件下划分与模板两条链两侧互补团结 ，这一历程叫退火 ，第三步是DNA聚合酶在适当温度下将脱氧核苷酸（dNTP：dATP, dCTP, dTTP dGTP）沿引物5’—3’偏向延伸合成新股DNA ，这一历程叫延伸 。变性—退火—延伸 ，云云循环往复 ，每一循环爆发的新股DNA均能成为下一次循环的模板 ，故PCR产品是以指数方法即2n扩增的 ，经由30-35个循环 ，目的片断可以扩增到一百万倍 ，在一样平常PCR仪上 ，完成这样的反应需几个小时 。
PCR原理示意图
二、实验要领
1．在冰上 ，建设如下PCR反应系统 ，在PCR管内划分加入：
10×PCR缓冲液 2μL
25mM dNTPS 1.6μL
2．5mM MgCl2 1.2μL
Primer 1（10μM） 0.8μL
Primer 2（10μM） 0.8μL
模板DNA（1μg/μL） 1μL
Taq酶（5Μ/μL） 0.2μL
dd H2O 12.4μL
总体积 20μL
2．将PCR管放入PCR仪中 ，按如下程序操作 。
①94℃预变性2min (最先时模板DNA变性要适当延伸)
②94℃变性1 min → 36℃退火1 min → 72℃延伸2 min,共40个循环
③72℃延伸7 min（最后一次延伸的时间也要适当延伸）
④4℃贮存 。
3．取1—5μL反应产品举行当琼脂糖凝胶电泳检测 。
三、PCR优化
要获得预期的PCR扩增效果 ，从中选定最为适用、重复性最好的条件 ，要试用差别的反应组分和循环参数 ，其中Mg2+浓度、dNTP浓度、模板DNA含量和Taq酶含量等因素对实验效果都有很大影响 ，在准备实验中 ，应划分举行梯度实验和交互组合实验 ，最终确定优化的PCR反应系统 。
四、所需仪器、耗材
1．微量移液枪
2．微量移液枪头
3．PCR管
4．PCR仪
5．离心机
6．离心管
7．玻璃器皿
五、所需试剂
1．随机引物（Primer）（10μM）
2. dNTP (25mM)
3. 模板DNA（1μg/μL）
4．Taq DNA聚合酶（5Μ/μL）
5. 10×PCR缓冲液
6．TBE
7．加样缓冲液
8．MgCl2（25mM）
六、试剂配制
1．琼脂糖凝胶电泳所需试剂同实验四一样 。
2．引物的配制：
订购的引物大多为干粉 ，附在管壁上 ，翻开时极易散失 ，以是翻开管子前先离心 ，然后再逐步翻开管盖 ，消融、调解浓度后 ，盖上管盖 ，充分上下振荡5—10分钟 ，不必时在-20℃以下生涯 。
在干粉管上一样平常都标有260nm下的吸光值 ，并标出碱基对数 ，例如一个管标为5 OD的20 mer oLigo DNA意思为一个20bp, 260nm下吸光值为5 OD的寡聚DNA 。
分子量（MV）=（A碱基数×312）+（C碱基数×288）+（G碱基数×328）+（T碱基数×303）-61
分子量也可以用以下近似要领盘算：
一个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5 ，则一个引物的分子量=碱基数×324.5
例如：现有一个引物管标为0.2 OD 10 mer如配制引物浓度为10μM,要领如下：
分子量=10×324.5=3245
质量数=0.2×33=6.6μg (1 OD ssDNA=33μg)
摩尔数=6.6μg/3245=0.002 μmoL=2 nmoL
（2 nmoL/10μM）×1000=200μL
以是应加200μL水 ，此管引物才华调解为10μM 。
七、思索题
1． PCR的反应原理是什么？
2． PCR反应系统包括那些因素？
实验六 随机扩增多态性DNA反应（RAPD）
一、相关知识
遗传标记（genetic markers）是研究生物遗传变异纪律及其物质基础的主要手段 。其要领主要有4种类型 ，即形态标记（morphological markers）、细胞学标记（cytological markers）、生化标记（biochemecal markers）和分子标记（molecular markers） 。与前三种标记相比 ，分子标记具有以下优越性：（1）直接以核酸作为研究工具 ，在植物体的各个组织、各个发育时期均可检测 ，不受季节、情形限制 ，与发育时期无关 ，可用于植物基因型的早期选择 。（2）标记数目极多 ，普遍整个基因组 。（3）多态性高 ，由于自然保存着许多等位变异 ，不需专门创立特殊的遗传质料 。（4）由许多分子标记体现为共显性（codominance） ，能够判别出纯合基因型与杂合基因型 ，可提供完整的遗传信息 。
现在 ，常用的分子标记手艺主要有限制性长度片断多态性（restriction fragment length polymorphism ，RFLP）、随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA ，RAPD）、扩增片断长度多态性（amplified fragment length polymorphism ，AFLP）、简朴重复序列（simple sequence repeats ，SSR）、染色体或基因组原位杂交（genomic in situ hybridization ，GISH）、mRNA差别显示（mRNA differential display ，mRNA-DD）、抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization ，SSH）、消减杂交法（subtractive hybridization ，SH）、代表性差别剖析法（representation difference analysis ，RDA）、恣意引物PCR（arbitrary-primer PCR ，AP-PCR）、DNA扩增指纹（DNA amplified fingerprinting ，DAF）、单引物扩增反应（single primer amplification reaction ，SPAR）、顺序表达位点扩增（sequenced characteried amplified region ，SCAR）、加锚微卫星寡核苷酸（anchored microsatellite oligonucleotide ，AMO）、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism ，SNP）、序列标签位点（sequence-tagged site ，STS）等等 。
一、实验原理
RAPD手艺建设于PCR手艺基础上 ，它是使用一系列（通常数百个）差别的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链（通常为十聚体）为引物 ，模板在92-94℃变性解链后 ，若是双链DNA分子在一定长度内具有反向平行又与引物互补的片断 ，引物的位置是在相互可扩增的距离内（引物间距为200-2000bp） ，那么不一连的分子量为200-2000bp的DNA片断就会通过PCR爆发 。高温变性、低温退火、适度延伸 ，云云往复循环 ，经由30～40个循环 ，产品即可扩增到百万倍以上 ，云云高产的DNA片断经电泳疏散和EB染色后 ，直接在紫外视察和照相 。
RAPD手艺简朴、容易掌握 ，在短期内可获得大宗的遗传标记 ，这些优点逐渐被人们接受后 ，生长神速 ，短短三年中在生物学的诸多领域 ，如遗传指纹作图、检测遗传多样性与稳固性（品种判断、物种起源与进化）等 。
三、实验要领
（一）DNA的提取
同前CTAB法 。
（二）纯度检测及浓度调解
同实验四 。
（三）操作程序
1．反应系统的制备
冰上建设如下反应系统 ，夹取一支PCR管 ，划分加入下列因素：
10×PCR Buffer 2.0 ?l
模板DNA（500ng/?l） 1.0 ?l
dNTPs（2.5mM） 1.6 ?l
MgCl2 （25mM） 2.0 ?l
Primer（20?M） 1.2 ?l
Taq酶（2.5U/?l） 0.5 ?l
加ddH2O至总体积 20.0 ?l
上下吸打混匀 ，离心网络 �？笪镉头飧� 。
2．扩增程序
然后将PCR管放入PCR仪中 ，按如下程序操作 。
94℃ ，预变性5min；94℃变性1min ，37℃退火1min ，72℃延伸2min ，40个循环；72℃延伸7min ，4℃生涯 。
3．琼脂糖凝胶电泳检测
要领同实验三 ，胶浓度为2% 。
四、反应的影响因素及注重事项
（一）影响因素
在RAPD反应历程中 ，涉及的反应因子许多 ，且对反应条件敏感 ，任何一个反应因子设置不当 ，都会影响整个反应的历程 ，或者改变带型 。通常情形下 ，实验室要系统地探索各反应条件及影响因子 ，优化反应系统 ，获得一个实验条件标准的RAPD反应 。
反应历程中的影响因子主要有Taq酶、Mg2+浓度、扩增反应温度和时间、循环周期、引物、dNTPs浓度和DNA浓度及纯度等 。因而在实验前要对反应系统及扩增条件举行充分的优化 。
（二）注重事项
1．冰上配制PCR反应液 ，然后置于PCR仪上举行反应 。
2．DNA质量要求高 ，应纯化并特殊注重避免氧化 。
3．反应迅速 ，易爆发污染而造成假阳性 ，因此要有比照反应 。
4．注重影响因素 ，并注重“平台效应”的爆发 。
5．若产品的特异性较低 ，则可在反应混淆物中加入5%的二甲基亚矾（DMSO）等以提高产品特异性 。
6．如若产品在琼脂糖凝胶上区分率较低 ，则可用聚丙烯酰胺凝胶或梯度凝胶电泳要领来提高区分率 。
五、所用仪器、耗材
PCR仪；微量移液器；离心机；紫外剖析仪；电泳装置；PCR管；无菌Tip头；玻璃器皿等
六、所需试剂
10×PCR Buffer；模板DNA；dNTPs（2.5mM）；MgCl2 （25mM）；随机引物（20?M）；Taq酶（2.5U/?l）；加样缓冲液；琼脂糖等 。
七、思索题
1．试述RAPD手艺与PCR手艺的区别 。
2．试述为什么RAPD手艺重复性较差？
实验七 甜菜M14品系AFLP剖析
一、相关知识
（一）基因组DNA限制性核酸内切酶酶切
在基因工程手艺中 ，酶切反应为一个要害性的操作历程 ，选择合适的限制性内切酶 ，将载体切成切合要求的片断 ，以便于外源基因的插入 。核酸内切酶就是从DNA链的内部举行切割的酶 。核酸内切酶分为两类 ，一类称为非限制性内切酶 ，另一类称为限制性内切酶 。非限制性内切酶就是指那些不识别特定的DNA序枚举行切割的内切酶 ，如脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ） ，是从牛的胰腺中提取出来的内切酶 ，DNase Ⅰ对单、双链DNA都很敏感 。它可以在DNA链内的恣意位置切断磷酸二酯键 ，没有特定的识别序列 。一样平常说来 ，经DNase Ⅰ酶解处置惩罚过的DNA系统中最终只会剩下被降解下来的单核苷酸和很短的寡聚核苷酸链 。
限制性内切酶则与非限制性内切酶相反 。它们都能识别一定的DNA序列 ，在一定的条件下切断DNA链 。限制性内切酶分成三种类型 ，即类型Ⅰ限制性内切酶识别的DNA序列长约十几个核苷酸 ，或甲基化 ，或在离该识别序列一端约1000bp的位置上切割DNA ，类型Ⅰ限制性内切酶只特定地识别DNA序列 ，而切割位点却不特定；类型Ⅲ限制性内切酶与类型Ⅰ限制性内切酶有些差别 ，它也可识别特定的DNA序列 ，但它切割DNA的位点 ，往往在识别团结位点很相邻的位置上而不是1000bp那么远；只管云云 ，它的切割位点仍就不特异 。因而Ⅰ型限制性内切酶与 Ⅲ 型限制性内切酶在基因操作手艺中的应用远景并不普遍 。类型Ⅱ限制性内切酶不但能特异识别DNA序列 ，并且识别的DNA序列与酶切割DNA的位置是一致的 ，它阻止了酶切最后的不确定性和可重复性 ，因而在基因重组手艺中有普遍使用 。大大都的限制性内切酶并不是在DNA两条链的统一个位置切断的 ，而是两条链错开两至四个核苷酸断裂 ，这样爆发的DNA最后会带有5′突出或是3′突出的DNA单链 ，这种最后称为粘性最后 。
酶切通常凭证操作目的的差别而选择差别的酶切方法 ，如单酶切、双酶切、部分酶切等等 。单酶切是DNA片断化最常用的要领 ，用一种限制性核酸内切酶切割DNA样品 。而双酶切的两种限制性核酸内切酶可以先后划分在差别的反应系统中切割DNA样品 。接纳这种要领 ，应先用需要较低盐浓度缓冲液的酶举行切割 ，然后调理缓冲液的盐浓度 ，再加入需要较高盐浓度缓冲液的酶举行切割 。若是两种限制性核酸内切酶的最适反应温度差别 ，则应先用最适反应温度较低的酶举行切割 ，升温后再加入第二种酶举行切割 。若两种限制性核酸内切酶的反应系统相差很大 ，会显着影响双酶切效果 ，则可以在第一种酶切割后 ，经由凝胶电泳接纳需要的DNA片断 ，再选用合适的反应系统 ，举行第二种限制性核酸内切酶的切割 。
（二）粘性最后的毗连
在细胞中 ，行使毗连功效的是毗连酶（ligase） ，这是一类很特殊的酶 ，它催化DNA或RNA相邻的5′磷酸基和3′羟基最后之间形成磷酸二酯键 ，使DNA单链缺口封合起来 。常用的毗连酶主要有DNA毗连酶和RNA毗连酶 ，其主要作用为中止修复功效和毗连功效 。
理论上讲 ，毗连反应的**温度是37℃ ，由于在37℃时毗连酶的活性最高 ，但在现实实验中 ，37℃时粘性最后DNA分子形成的配对结构极不稳固 ，因此 ，人们需要找到一个最适温度 ，它既要利于最大限度地施展毗连酶的活性 ，又要有助于短暂配对结构的稳固 。现在 ，常用的毗连温度为12-16℃ 。
由于粘性最后比平最后具有更高的毗连效率 ，因此 ，在做DNA重组毗连实验历程中 ，人们往往优先选择粘性最后毗连 。但现实上 ，并不是所有的毗连都已具备了合适的粘性最后 ，例如大大都情形下一个是粘性最后分子 ，另一个是平最后DNA ，或是两个分子划分具有差别的粘性最后等等 。在这些情形下 ，人们可以接纳衔接体（linker）手艺、接合体（adaptor）手艺和同聚体（homo polymer）加尾手艺等 。
（三）选择性PCR扩增
原理与标准的PCR完全相同 ，区别仅在于PCR所用引物差别 。标准PCR的引物为已知序列互补的核苷酸顺序 ，而选择性扩增中 ，针对中心未知的核苷酸顺序人为的在已知顺序引物的后面随机加上1~3个碱基（要包管一定的GC含量） ，这样只有与随机的三个碱基互补配对的片断才可能从大宗的片断中被扩增出来 ，因而可凭证选择性碱基的数目来控制扩增片断的几多 ，抵达选择性的目的 。
引物的组成：（1）焦点碱基序列 ，该序列与人工讨论互补；（2）限制性内切酶识别序列；（3）引物3′端选择碱基 。
（四）聚丙烯酰胺凝胶电泳
依据制备凝胶的质料 ，凝胶电泳可分成两个亚类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳 。聚丙烯酰胺疏散小片断DNA/RNA（5—500bp）**** ，其区分力极高 ，相差1bp的DNA片断就能脱离 ，其缺乏之处为制备和操作较为难题 。琼脂糖凝胶的区分能力要比聚丙烯酰胺凝胶低 ，但其疏散规模较广 。用种种浓度的琼脂糖凝胶可以疏散长度为200bp至近50kb的DNA/RNA片断 。
常用聚丙烯酰胺凝胶有以下两种：
（1）用于疏散和纯化双链DNA片断的非变性聚丙烯酰胺凝胶
大大都双链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁徙速率简陋与其巨细的1g对数值成反比 ，但迁徙率也受其碱基组成和序列的影响 ，以致巨细完全相同的DNA ，其迁徙率可相差达10% ，这种作用是由于双链DNA在特定序列上形成扭结而造成的 。
（2）用于疏散、纯化单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶
这些凝胶在一种可以抑制核酸中的碱基配对的试剂（如尿素或甲醛）保存下聚合 ，变性DNA在这些凝胶中的迁徙速率险些与其碱基组成及序列完全无关 。放射性DNA探针的疏散、S1核酸酶消化产品的剖析及DNA测序反应产品的剖析 ，均接纳变性聚丙烯酰胺凝胶 。
（五）AFLP手艺
1．AFLP手艺的优点
理论上由于AFLP接纳的限制性内切酶和选择性碱基的种类、数目较多 ，以是AFLP可爆发的的标记数目是无限的；基因型的AFLP剖析 ，每次反应产品经非变性PAGE电泳检测到的谱带数在50～100条之间 ，以是该手艺是DNA多态性检测的一个很是有用的手艺；AFLP标记是典范的孟德尔方法遗传；AFLP剖析的大大都扩增片断与基因组的简单位置相对应 ，因此AFLP标记可以用于作为遗传图谱和物理图谱的位标；AFLP 既可以用于剖析差别庞洪水平的基因组DNA ，也可用于剖析克隆的DNA大片断 ，因此它不但是一种DNA指纹手艺 ，也是基因组研究的一个很是有用的工具；DN A的随机扩增 ，受模板浓度的影响较大 ，而AFLP的一个主要特点是对模板浓度转变不敷敏感 。VOs等人在西红柿的 AFLP剖析历程中发明模板浓度相差1000倍的规模内 ，获得的效果基本一致 。只是模板浓度很低时 ，谱带较弱 ，甚至有缺失；AFLP手艺另一个主要特点是 ，在反应历程中 ，标记的引物会所有耗尽 ，当引物耗尽后 ，扩增带型将不受循环数的影响 。由于AFLP对模板浓度不敏感 ，这样使用过剩的循环数 ，纵然模板浓度保存一些差别 ，也会获得强度一致的谱带 。因此AFLP手艺能够检测谱带强度的多态性 。
2．AFLP与其它分子标记手艺的较量
每一种分子标记都具有其优点和弱点 。关于相同的质料 ，用差别的分于标记展现的多态性是保存差别的 ，一样平常AFLP的多态性比率最大 ，RFLPRAPD次之 。Wang等在对水稻温敏不育等位系的研究中报道 ，三种分子标的多态性比率依次为AFLP〉RAPD〉RFLP（26.67%；4.00%；1.67%） 。同时Lin等在大豆的剖析中同样证实AFLP的多态性最高 。
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特征 RFLP RAPD AFLP
漫衍 普遍 普遍 普遍
可靠性 高 中等 高
重复性 高 中等 高
遗传性 共显性 显性 显性或共显性
多态性 中等 高 很是高
DNA需求 2－30ng 1-100ng 100ng
放射性 一样平常有 无 有或无
手艺难度 中等 简朴 中等
样品生产率 中低 高 很是高
时间因素 长 快 中等
与其它分子标记相比 ，AFLP的特点主要体现在它团结了RFLP及RAPD各自的优点 ，利便快速 ，只需要少少量DNA质料 ，不需要Southern杂交 ，不需要预先知道DNA的顺序信息 ，试验效果稳固可靠 ，可以快速获得大宗的信息 。并且再现性高 ，重复性好 ，因而很是适合于品种指纹图谱的绘制 ，遗传连锁图的构建及遗传多样性的研究 。在一些多态性很少并且待测样品较少的情形下 ，用AFLP剖析能抵达知足的效果 。对高密度基因图谱的绘制或对某个基因所在区域的细腻作图 ，AFLP是较为理想的要领 。AFLP所爆发的多态性远远凌驾了RFLP、RAPD等 ，现在被以为是DNA指纹图谱手艺中多态性最为富厚的一项手艺 。
3．AFLP手艺的应用
AFLP手艺降生以来 ，己普遍地用于生物的基因组剖析 。如植物的抗性基因定位及染色体作图 ，病原菌的亲缘关系剖析 。由于它对基因组的细小转变具有较好的区分能力 ，因而它也被普遍地用于统一病原真菌的营养体的亲和群及病菌的无毒基因与病菌的毒性剖析 。
①AFLP手艺用于细菌的分类和判断的研究
ALFP的可重复性比RAPD要强 ，在细菌分类方面的适用规模与RAPD、RFLP和细菌可溶性卵白质谱相似 。但AFLP综合以上各要领的优点 ，区分率仅低于全基因组序列剖析 ，稳固性强 ，可提供更为富厚的分类信息 。
②AFLP手艺用于真菌分类研究
AFLP是一种强有力地体现真菌分子特征的新手艺 ，其操作历程利便 ，区分判断效果可靠 ，该手艺在病原真菌方面的应用己十分引人注目 ，己生长出一些适用的程序来区别一些特殊菌株 ，用于分型、判断并研究其亲缘关系 。它可以剖析其差别种属间的差别 ，甚至还可以展现种内差别菌株间的细微差别 ，从而填补了表型分型的缺乏 ，更为准确地剖析致病真菌实质上的差别 。该手艺被应用于镰刀菌（Fusarmiu graminearum）差别泉源疏散株的判断和区别 ，获得了优异效果 。
二、实验原理
1991年 ，Gustava等人用很是短的5个碱基、8个碱基及10个碱基的寡核苷酸片断作引物 ，随机扩增人、动物、植物、真菌、细菌以及病毒DNA获得乐成 ，他们称之为扩增片断长度多态性（Amplification Fragment Length Polymorphisms ，AFLP） 。1992年由Zabeau 和Vos建设的AFLP手艺与前述内容大不相同 ，该要领团结了RFLP(restriction fragment Length polymorphisms)手艺和RAPD手艺的特点 ，使用人工讨论（Adaptor）与限制性内切酶酶切的基因组DNA片断毗连并以此为DNA模板 ，合成系列3`—最后随机转变数个碱基且与人工讨论序列相互补的PCR引物 ，来举行PCR特异条件扩增 ，经电泳检测后可获得DNA指纹图谱 。
基因组DNA
CTGCAGNNNN…NNNNCTGCAG…
GACGTCNNNN…NNNNGACGTC
PstⅠ酶切
GNNNN…NNNNCTGCA
ACGTCNNNN…NNNNG
加人工讨论
5’---CTCGTAGACTGCGTACATGCA---3’
3’--- CATCTGACGCATGT ---5’
T4毗连酶毗连
lCTCGTAGACTGCGTACA TGCA GNNNN…NNNNCTGCA
CATCTGACGCATGT ACGT CNNNN…NNNNG
选择引物PCR扩增
CTCGTAGACTGCGTACATGCAGNNNN…NNNNCTGCA
CATCTGACGCATGTACGTCNNNN…NNNNG
Ps1--GACTGCGTACATGCAGACC
Ps2—GACTGCGTACATGCAGCTG
凝胶检测
（一）基因组DNA限制性核酸内切酶酶切
限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的 ，如反应温度、缓冲系统、离子种类与浓度、DNA的纯度、DNA分子的甲基化水一律等 。限制性内切酶的反应缓冲液中一样平常含有MgCl2 ，NaCl或KCL ，Tirs-HCl ，二硫苏糖醇（DTT）或β-疏基乙醇 ，有的还含有牛血清卵白（BAS） 。Mg2+是限制性内切酶的辅助因子 ，Tris-HCL坚持整个反应系统的pH值；差别的酶关于Na+或K+有差别的要求 ，DTT和β-疏基乙醇有助于酶在系统中的稳固 。
DNA的纯度关于酶切效果影响很大 ，由于卵白质、酚、氯仿、SDS等杂质污染DNA以后 ，能直接抑制酶的活性 。在实验时 ，为了战胜这些杂质的影响 ，接纳的步伐或者是延伸反应时间 ，或是增添酶量 ，也可以既增添酶量 ，又延伸反应时间取得好的反应效果 。
差别的限制性内切酶 ，其最适反应温度也可能差别 ，内切酶标准反应温度为37℃ ，但也有许多破例 ，如Sma I 的最适反应温度为25℃ ，Taq I 的最适反应温度为65℃ 。内切酶的活性界说：在50 μL反应液中 ，相宜的温度下反应1小时 ，将1μg的λDNA完全剖析的酶量界说为1个活性单位 。
限制性内切酶的贮存液通常含有50%的甘油 ，而甘油在反应系统中凌驾5%时 ，就会影响酶切的特异性 ，因此作酶切反应时加入酶的体积不应凌驾反应总体积的1/10 。
酶切的时间因实验而异 ，是由DNA样品的浓度、纯度及酶的浓度决议的 。DNA样品浓度高、纯度差或酶的浓度太低都可以适当延伸酶切时间 。酶切系统的体积一样平常以20-50 μL为宜 。若是DNA样品是基因组DNA ，那么时间可以延伸至18个小时或过长 。
EcoR Ⅰ：
5′----GAATTC---3′ 5′---G AATTC---3′
3′----CTTAAG---5′ 3′---CTTAA G---5′
Pst Ⅰ:
5′---CTGCAG---3′ 5′---CTGCA G---3′
3′---GACGTC---5′ 3′---G ACGTC---5′
BamH Ⅰ:
5′---GGATCC---3′ 5′---G GATCC---3′
3′---CCTAGG---5′ 3′---CCTAG G---5′
（二）讨论的毗连
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（三）选择性PCR扩增
（四）聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶（poLyacryLamide geL, PAG）是由丙烯酰胺（acryLamide）和交联试剂N ，N’—甲叉双丙烯酰胺（Bis；N ，N’—methyLenebisacryLamide）在有引发剂如过硫酸胺和增速剂如N,N,N’,N’—四甲基乙二胺(TEMED)保存的情形下聚合而成的 。丙烯酰胺的单体形生长键 ，由N,N’—甲叉双丙烯酰胺的双功效基团和链最后的自由功效基团反应而爆发交朕形成凝胶 ，凝胶的孔径由链长和交联度所决议 。
聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳都比琼脂糖凝胶更为费事 。聚丙烯酰胺凝胶险些总是装于两块玻璃板之间 ，两块玻璃板由距离片离隔,并封以绝缘胶布 。在这种设置的形式下 ，大大都丙烯酰胺溶液不会与空气接触 ，以是氧对聚合的抑制局限于凝胶顶部的一个窄层里 。聚丙烯酰胺凝胶一律是举行笔直电泳 ，凭证疏散的需要 ，其长度可以在10—100cm之间 。聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有3个主要优点：①区分力强 ，长度仅仅相差0.2% (即500bp中的1bp）的DNA分子即可脱离；②所能装载的DNA量远远大于琼脂糖凝胶 ，多达10μg的DNA可以加样于聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽而不致显著影响区分力；③从聚丙烯酰胺凝胶中接纳的DNA纯度很高 ，可适用于要求最高的实验 。
三、实验要领
（一）基因组DNA限制性核酸内切酶酶切
1．本试验所用DNA为从甜菜叶中提取的基因组DNA ，选用三种限制性内切酶举行单酶切反应 ，划分为Pst Ⅰ、和BamH Ⅰ和EcoRⅠ酶 。
2．取三个0.5mL离心管 ，按顺序加入以下因素 ，反应总体积为 20μL 。
灭菌水 16μL
10×限制性内切酶缓冲液 2 μL
基因组DNA（1mg/mL） 2 μL
限制性内切酶 1 μL
3．上下吸打混匀 ，快速离心网络使溶液所有聚于管底部 ，将离心管放在水浴中 ，凭证差别酶的**作用温度保温2.5—4 h 。
4．置65℃水浴中灭活15分钟 ，终止酶切反应 。
5．取10 μL酶切过的溶液 ，加入2 μL 6×上样缓冲液在1% 琼脂糖凝胶上电泳 ，电泳时以分子量Marker为分子量比照 ，电泳电流为60--100mA 。
6．电泳竣事后 ，在紫外灯下举行视察 ，酶解完全的总DNA在泳道上应呈匀称的弥散状 ，其中还经�？杉烈恍┑奶醮� ，这些是重复序列 。
（二）讨论的毗连
1．每种限制性内切酶都有各自配对的讨论 ，其序列详细如下：
EcoR Ⅰ：
Ead1： 5′--CTC GTA GAC TGC GTA CC--3′
Ead2： 3′--CAT CTG ACG CAT GGT TAA--5′
Pst Ⅰ：
Pad1： 5′--CTC GTA GAC TGC GTA CAT GCA--3′
Pad2： 3′--CAT CTG ACG CAT GT--5′
BamH Ⅰ：
Bad1： 5′--GGG TCG AAT TCG AGC TCA G--3′
Bad2： 3′--CCC AGC TTA AGC TCG AGT CCT AG--5′
2．讨论的制备：
①先将讨论中每个单链部分派制成浓度为50μM的溶液 ，凭证摩尔数盘算加水量；
②划分从两管中取25μL溶液加入PCR管中 ，经94℃变性2min ，36℃退火5min后 ，自然冷却至室温 ，两个互不寡聚核苷酸链便团结成为人工讨论 ，做好标记备用 。
3．制备毗连反应系统：
取一支PCR管 ，冰上依次加入下列因素：
酶切模板DNA 250 ng（5 μL）
25μM讨论 0.2 μL
T4 Ligation Buffer 5 μL
T4 Ligase（3U/μL） 0.6 μL
ddH2O 39.2 μL
总体积 50 μL
4．吸打混匀 ，16℃条件O/N ，举行毗连反应 。
5．加0.1×TE Buffer至终体积250 μL ，4℃生涯备用 。
（三）选择性PCR扩增
1．三种限制性内切酶用到的选择扩增引物 ，其序列详细如下：
EcoR Ⅰ：
Es1： 5′--GAC TGC GTA CCA ATT CGT C--3′
Es2： 3′--GAC TGC GTA CCA ATT CAG C--5′
Pst Ⅰ:
Ps1： 5′--GAC TGC GTA CAT GCA GCT G--3′
Ps2： 3′--GAC TGC GTA CAT GCA GAC C--5′
BamH Ⅰ:
Bs1： 5′--TTC GAG CTC AGG ATC CGT G--3′
Bs2： 3′-- GAG CTC AGG ATC CAC G--5′
2．选择引物的制备：
使用前凭证摩尔数将引物配制成终浓度66 ng/μL ，备用 。
3．制备PCR反应系统：
取一支PCR管 ，冰上依次加入下列因素：
10×PCR Buffer 2.0 μL
2.5 mM dNTP 1.6 μL
25 mM MgCl2 1.2 μL
选择引物 1.0 μL
TaKaRa Ex Taq（5U/μL） 0.2 μL
毗连模板DNA 10.0 μL
ddH2O 4.0 μL
总体积 20 μL
4．吸打混匀 ，离心网络 。
5．PCR仪扩增 ，循环程序如下：
94℃ ，5 min
94℃ ，30 sec
68℃ ，30 sec（每个循环降低0.7℃） 12 Cycles
72℃ ，1 min
94℃ ，30 sec
56℃ ，30 sec 23 Cycles
72℃ ，1 min
72℃ ，5 min
4℃生涯 ，Hold 。
（四）聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
1．已商品化的电泳装置有多种类型 ，而玻璃板与距离片之间的设置也因制造厂商的差别而略有差别 ，距离片的厚度介于0.5—2.0mm 。凝胶越厚 ，电泳时爆发的热量就越大,过热会导致泛起“微笑”DNA条带或其他问题 ，因此 ，凝胶薄一点更好 。在玻璃板与距离片之间要形成不透水密封 ，以免未聚合的凝胶溶液漏出 。一样平常两块玻璃板的巨细略有差别 。本实验所用的电泳槽为北京六一仪器厂生产的DYY—III 28D型电泳槽 。实验前 ，把玻璃板及橡胶框要彻底洗濯 ，然后划分把两块玻璃板插入橡胶框中 ，其中小玻璃板插入带有下凹槽的缝中 。用琼脂糖（1~1.2%）将大、小玻璃板的底部封住 。一个电泳槽有两个这样的橡胶框 。
2．将载有玻璃板的两个橡胶框划分放入电泳槽的夹隔中 ，其中短玻璃一面向内 ，牢靠位置 ，拧紧两侧及底部的螺丝 。
3．拿两个50mL小烧杯 ，按下表划分派制40mL的聚丙烯酰胺凝胶溶液 。在配制聚丙烯酰胺凝胶溶液时 ，可以先把水、40%丙烯酰胺、5×TBE和10%过硫酸胺混淆 ，比及灌胶前再加入TEMED ，不然凝胶要很快聚合 。
4．将电泳槽斜靠在一白色瓷盘边上 ，与桌面约莫成10—20°角 ，向混淆液中加入TEMED ，旋动烧杯以混匀溶液 。
| 制备差别浓度（%）凝胶所用试剂的毫升数（总体积40mL） | |||
6% | 5.5% | 5% | 4% | |
H2O 25.6mL | 26.1mL | 26.6mL | 27.6mL | |
40%丙烯酰胺 6mL | 5.5mL | 5mL | 4mL | |
5×TBE 8mL | 8mL | 8mL | 8mL | |
10%过硫酸胺 360μL | 360μL | 360μL | 360μL | |
TEMED 40μL | 40μL | 40μL | 40μL | |
5．将烧杯中的溶液沿下方的橡胶框中的长玻璃液一侧倒入两块玻璃板的逍遥处 ，注满至顶部 ，若有气泡 ，用一细棒将其倾轧 。
6．连忙插入适当的梳子 ，梳子平的一侧要靠近长玻璃板 。
7．将电泳槽反转过来 ，使另一个没有灌胶的橡胶框处在下方 ，用同样要领灌胶 。
8．将电泳槽放正 ，在室温下聚合60分钟 。若是凝胶显着缩短 ，应补加丙烯酰胺溶液 。聚合完全后 ，在梳子下方可以望见折射率差别的纹线 。
9．若是不接通冷却水循环装置 ，应用夹子夹紧毗连贮液槽的两根橡胶管 。
10．凝胶聚合完毕后 ，小心取出梳子 ，连忙用水冲洗加样孔 ，用1×TBE灌满电泳槽的缓冲液槽 。
11．接上电极 ，上贮液槽导线与电泳仪的负极相连（黑对黑） ，下贮液槽导线与电泳仪的正极相连（红对红） ，设定电压及电流 ，按下电泳仪的事情开关 ，举行预电泳20—30分钟以除去加样孔处的杂质 。
12．将事情开关放到预置挡的位置 ，将DNA样品与适量的凝胶加样缓冲液混淆 ，用移液枪吸收混淆液 ，将Tip头靠近加样孔对应的长玻璃板注入样品 。
13．设定好电压及电流(一样平常设置恒流30 mA ，亦可在200V) ，按下电泳仪的事情开关 ，举行电泳（约莫3—4个小时） 。
14．电泳至标准参照前沿指示剂位置时 ，切断电源 ，拨出导线 ，弃去缓中液槽内的电泳缓冲液 ，拧开牢靠螺丝 ，卸下玻璃板和橡胶框 ，用薄钢勺将上面的玻璃板从一角撬起 ，用洗瓶冲洗凝胶 ，使凝胶完全附在一个玻璃板上 ，再用洗瓶冲洗凝胶与玻璃板的逍遥 ，使凝胶彻底与玻璃板疏散 ，用水的实力把凝胶突入白瓷盘中 ，（在此历程中 ，切勿用手及其它工具接触凝胶） 。
15．用去离子水洗濯凝胶3次 ，然后放入牢靠液中（牢靠液的体积以没过胶面0.5cm为宜）牢靠10分钟 。
16．倒掉牢靠液 ，用去离子水洗濯凝胶3次 ，然后放入染色液染色10分钟 。
17．倒掉染色液 ，用去离子水洗濯凝胶3次 ，然后放入显影液中显影10—20分钟 。
18．比及DNA条带清晰展现出来时 ，凝胶再用清水冲洗一遍 ，然后用10%甘油浸泡过的玻璃纸包好（不要有气泡） ，用夹子牢靠在玻璃板上 ，在室温下自然封干一夜 ，封干后取下干胶 ，举行区带剖析 。
19．视察纪录 ，效果剖析 。
四、实验要点
1．酶切时一样平常的加样序次为水、buffer、DNA ，最后加酶液 。
2．酶切反应为微量操作 ，Tip要从溶液外貌吸收 ，以避免Tip沾去过多液体与酶 ，待用的内切酶要放在冰浴内 ，用后盖紧盖子 ，连忙放回－20℃冰箱 ，避免限制性内切酶的失活 。
3．由于温差缘故原由 ，往往在酶切反应的离心管盖上有水汽 ，因此样品酶切完毕或中心取样要离心2秒 ，以集中溶液,不然会发明酶切后体积减小 。
4．若电泳条带靠近加样孔的一端比另一端亮得多 ，批注酶切不完全 ，这可能是由于以下几个缘故原由：
①反应时间不敷长（若反应住宿则可扫除此项） 。
②酶量不敷或酶部分失活 ，当一管酶加到最后时�；嵊龅胶笠恢智樾� 。
③若是DNA样品溶于TE缓冲液中且在酶解反应中所占的体积较大时 ，TE缓冲液中的EDTA可能抑制酶解反应 ，这时可用乙醇重新沉淀DNA ，其办法为加入1/10体积的3M NaAC ，再加入2.5倍体积的无水乙醇 ，离心（14000g×15min） ，去上清 ，再加入75%乙醇（50 μL）洗DNA沉淀 ，再离心（14000g×15min） ，去上清 ，干燥后重新溶于少量TE缓冲液或SWD中 。
5．若泳道中的DNA系带混杂 ，可能是由于DNA样品在初始缓冲液中只是部分消融或者是由于乙醇沉淀后DNA样品中仍剩余有乙醇 。
6．电泳条带下部较其他部位亮得多 ，这可能是由于样品中混有RNA或DNA样品爆发了降解 。
五、所需仪器、耗材
1．30℃、37℃、65℃水浴 2．电泳仪
3．水平电泳槽 4．笔直板电泳槽
5．移液枪 6．冻冷离心机
7．紫外视察仪 8．高压灭菌锅
9．紫外凝胶成像系统 10．磁力搅拌器
11．酸度计 12．岛津紫外分光光度计
13．超低温冰箱 14．纯水仪
15．低温循环水浴锅 16．超速离心机
17．冰箱 18．鼓风干燥箱
19．冷冻干燥离心机 20．PCR仪
21．离心管 22．种种细口瓶及烧杯
23．夹子 24．玻璃纸
25．洗瓶 26．单面刀片
27．Tip头 28．PCR管
六、所需试剂
1．基因组DNA（1mg/mL） 2．分子量Marker
3．1×TBE配制的1%琼脂糖 4．溴化乙锭贮液（10mg/mL）
5．灭菌蒸馏水（SDW） 6．限制性内切酶及酶切反应缓冲液
7．3M NaAC 8．乙醇
9．上样缓冲液 10、Tris-HCl
11．硼酸 12．EDTA（乙二胺四乙酸）
13．过硫酸铵 14．TEMED（N-N-N’-N’-四甲基乙二胺）
15．冰醋酸 16．硝酸银
17．氢氧化钠 18．甲醛
19．丙烯酰胺 20．甲叉双丙烯酰胺（Bis）
七、试剂配制
1．5×TBE
终体积1L 终体积500mL |
Tris-HCl 54g 27g |
硼酸 27.5g 13.75g |
0.5moL/L EDTA (pH=8.0) 20mL 10mL |
2．0.5moL/L EDTA（pH=8.0）
在800mL水中加入186.1g EDTA-Na2·2H2O ，在磁力搅拌器上强烈搅拌 ，用NaOH调理溶液的pH值至8.0 ，然后定容至1L ，分装后高压灭菌备用 。
3．10% 过硫酸铵
过硫酸铵1g定容至10mL或者过硫酸铵0.1g定容至1mL 。
4．TEMED：商品试剂
5．牢靠液：10%乙醇 ，0.5% 冰醋酸
配制：50mL乙醇,2.5mL冰醋酸定容至500mL 。
6．染色液： 10%乙醇 ，0.5%冰醋酸 ，0.2%硝酸银
配制：50mL乙醇 ，2.5mL冰醋酸 ，1g硝酸银定容至500mL ，避光生涯 。
7．显影液：3%氢氧化纳 ，0.5%甲醛
配制：15g氢氧化纳 ，6.8 mL 37% 甲醛定容至500mL 。
8．40%丙烯酰胺（19：1）：
丙烯酰胺38g ，甲叉双丙烯酰胺2g加50mL水将溶液加热37℃ ，定容至100mL.
9．1% 琼脂糖：0.24g琼脂糖加20mL水 ，在微波炉中加热 。
八、思索题
1．影响酶切的因素有哪些？
2．酶切反应不完全的因素有哪些？
3．简朴形貌粘性最后的三种毗连手艺
4．与琼脂糖凝胶相比 ，聚丙烯酰胺凝胶主要有哪些优点？
5．在制备聚丙烯酰胺凝胶时 ，过硫酸胺和N,N,N’,N’—四甲基乙二胺（TEMED)的作用是什么？
6．试较量AFLP手艺与RAPD手艺 。
实验八 生物信息学
一、相关知识
（一）生物信息学的界说
生物信息学是在生命科学的研究中 ，以盘算机为工具对生物信息举行贮存、检索和剖析的科学 。它是当今生命科学和自然科学的重大前沿领域之一 ，同时也将是21世纪自然科学的焦点领域之一 。其研究重点主要体现在基因组学(Genomics)和卵白学(Proteomics)两方面 。
广义地说 ，生物信息学从事对基因组研究相关生物信息的获取、加工、贮存、分派、剖析息争释 。这一界说包括了两层寄义 ，一是对海量数据的网络、整理与效劳 ，也就是管好这些数据；另一个是从中发明新的纪律 ，也就是用好这些数据 。
详细地说 ，生物信息学是把基因组DNA序列信息剖析作为源头 ，找到基因组序列中代表卵白质和RNA基因的编码区；同时 ，剖析基因组中大宗保存的非编码区的信息实质 ，破译隐藏在DNA序列中的遗传语言纪律；在此基础上 ，归纳、整理与基因组遗传信息释放及其调控相关的转录谱和卵白质谱的数据 ，从而熟悉代谢、发育、分解、进化的纪律 。
生物信息学还使用基因组中编码区的信息举行卵白质空间结构的模拟和卵白质功效的展望 ，并将此类信息与生物体和生命历程的心理生化信息相团结 ，剖析其分子机理 ，最终举行卵白质、核酸的分子设计、药物设计和个体化的医疗保健设计 。
（二）研究生物信息学的须要性
首先陪同着基因组研究 ，相关信息泛起了爆炸性增添 ，迫切需要对海量生物信息举行处置惩罚 。自1995年科学家破译了全长为180万核苷酸的嗜血流感杆菌基因组以来 ，到现在已有约莫60个微生物和若干真核生物 ，如：酵母、线虫、果蝇、拟南芥的完整基因组完成测序 。至2001年的春天 ，科学家又宣布了人类基因组的绝大部分序列 ，即：人类基因组的事情草图 。这些成绩意味着基因组的研究将周全进入信息提取和数据剖析的崭新阶段 。凭证国际数据库的统计 ，1999年12月DNA碱基数目为30亿 ，2000年4月DNA碱基数目是60亿 ，现在这一数目已达140亿 ，约莫每14个月翻一番 。同时 ，电子盘算机芯片关于数字处置惩罚能力的增添也相当于每18个月翻一番 。因此 ，盘算性能够有用地治理和运行海量数据 。
可是 ，更为实质的缘故原由是基因组数据的重大性 。所谓某种生物的基因组就是指该生物所有遗传物质的总和 。生物的遗传物质是一类称为脱氧核糖核酸（DNA）的生物大分子 ，它是由4种核苷酸串接起来组成的 ，通常用字符A、T、G、C代表 。通俗地说 ，生物的遗传密码就是这4个字符毗连起来的线状长链 。这种链往往很长 ，好比：人的遗传密码就含有32亿个字符 ，将它们堆起来就组成了一部100多万页、每页有3000字符的“天书” 。这本“天书”包括了人体的结构和功效以及生运气动历程的大宗信息 ，却仅仅由4个字符组成 ，既无词法 ，又无句法 ，还没有标点符号 ，看起来每一页都是相似的 。怎样读懂它是个极大的难题 �；蜃檠芯孔钪帐且焉镅侍庾啥允址诺拇χ贸头Ｎ侍� 。要解决这样的问题就必需生长新的剖析理论、要领、手艺、工具 ，就必需依赖盘算机的信息处置惩罚 。
（三） 目今主要研究内容
1．获取人和种种生物的完整基因组；
2．发明新基因和新的单核苷酸多态性；
3．基因组中非编码卵白质；
4．在基因组水平研究生物进化；
5．完整基因组的较量研究；
6．从功效基因组到系统生物学；
7．卵白质结构模拟与药物设计；
8．生物信息学的应用与生长研究 。
二、实验原理
本实验的主要内容是将甜菜中的序列表达标签EST（Expressed sequence taqs）与已知数据库中的信息举行比对 ，从而掌握对未知序枚举行功效剖析的基本要领 。
EST是长约150～500bp的基因表达序列片断 。EST手艺是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体构建成cDNA文库后 ，大规模随机挑选cDNA克隆 ，对其5′或3′端举行一步法测序 ，所获序列与基因数据库已知序列较量 ，从而获得对生物体生长发育、滋生分解、遗传变异、朽迈殒命等一系列生命历程熟悉的手艺 。
将EST序列与GenBank举行同源性较量 ，Score值体现相似性水平 ，Score值越高 ，相似性（similarity）越大；E Value值体现随机匹配的可能性 ，E值越大 ，随机匹配的可能性越大；Identity值体现与数据库序列一致性的百分比；Positives 体现两条序列氨基酸性子相似比例；Gaps比对时插入空位的比例；Query为检测序列；Subject为数据库中的序列 。当Score≤80时 ，体现未知的EST是新的；当Score值很高时 ，体现未知的EST与响应的已知基因有高度的同源性 ，由此可推测此EST与已知基因具有相似的功效 。
EST序列剖析在EST研究中,使用最多的要领就是序列相似性较量 ，以此来确定EST的功效 。BLAST(Basic Local Alignment Search ToolA)是应用较广的工具软件之一 ，为同源剖析的软件包 ，包括有BLASTN、BLASTP、TBLASTN、TBLATX、BLASTX等5个软件 。BLASTN是将核酸序列与核酸数据库举行比对 ，BLASTP是将氨基酸序列与卵白质数据库举行比照 ，TBLASTN是将卵白质序列与核酸数据库所有6种翻译序列的比照 ，TBLASTX是将核酸序列的6种翻译序列与核酸数据库所有6种翻译序列的比照 ，BLASTX是将核酸序列的6种翻译序列与卵白质数据库的比照 。
三、实验要领
1．登陆美国国立生物手艺信息中心(NCBI National center for biotechnology information )网站 ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 。点击BLAST ，泛起一个新界面 。
2．在泛起的新界面中点击Nucleotide- nucleotide BLAST(blastn) ，进入另一界面 。
3．在此界面中的search中加入要剖析的序列 ，然后点击BlAST ，在非冗余库nr (non redundant)中搜索 ，泛起新界面 。
4．新界面会给出所申请序列的ID号码 ，点击Format 。
5．期待所提醒的时间 ，系统会泛起一系列与所剖析序列同源的已知基因的比对效果 。
四、所需仪器
30台电脑（可用于上网） 。
五、 思索题
1．生物信息学的界说？
2 .EST的寄义？
3．在生物信息学中BLASTN、BLASTP、TBLASTN、TBLATX、BLASTX所代表的寄义？
4 .怎样对未知基因或序列在nr中举行生物信息学的BLAST剖析？
