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实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
一、实验原理
体外毗连的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才华大宗的举行复制、增殖和表达。研究发明，用含Ca2+ 的溶液处置惩罚大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。大肠杆菌吸收外源DNA的历程被称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。用理化要领可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。
CaCL2法是现在实验室常用的制备感受态细胞的要领，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性爆发改变，外源DNA附着于细胞膜外貌，经42°C短时间热攻击处置惩罚，增进细胞吸收DNA复合物。宿主细胞一样平常是限制―修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才华生涯并生长增殖。从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。
本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处置惩罚受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。将经由转化后的所有受体细胞举行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板作育基上作育，只有转化体才华存活，而未有转化的受体细胞则因无对抗氨卞青霉素的能力而殒命。转化子经由扩增后，可将转入的质粒DNA疏散提取出来，用于电泳剖析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。
二、仪器及试剂
1. 仪器：
恒温摇床、电热恒温作育箱、电热恒温水浴锅、超净事情台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。
2. 质料
E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。
3. 试剂：
LB作育液（1L）：
胰卵白胨 10g
酵母粉 5g
NaCl 10g（高盐）或5g（低盐）
氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml
在三角瓶中将胰卵白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。待冷却至55℃，向溶液中加入1.5ml 100mg/ml 的氨苄青霉素。然后贮存于4℃备用。
LB平板作育基：
胰卵白胨 10g
酵母粉 5g
NaCl 10g或5g ，
琼脂 13g
在三角瓶中依次将上述配方加入1L的重蒸水中并高压灭菌。待作育基降温至50℃，取出作育基并轻轻旋转以使消融的琼脂匀称漫衍于整个作育基溶液中，凭证需要加入氨苄青霉素，然后可直接从三角瓶中倒出作育基铺制平板。90mm直径的作育皿约需30～50ml作育基。作育基完全凝聚后，倒置平皿并贮存于4℃备用。
其它试剂： 0.1M CaCl2溶液、灭菌蒸馏水
三、操作办法
1. 感受态细菌的制备：
（1）用接种环从E.coli JM109菌平板上挑取一单克隆菌落，接种于装有5ml LB液体作育基的试管中中，37℃ 220 rpm振荡作育住宿（12～16h）。
（2）取0.5 ml住宿菌液接种到装有50ml LB液体作育基三角瓶中中，37℃，220 rpm振荡作育2－3h，隔20－30min丈量OD600值，至OD600值为0.3-0.4。无菌条件下将细菌转至1.5ml 离心管中，每管1ml菌液，按需要决议管数。
（3） 4℃，12000 rpm，离心2 min，以接纳细菌。
（4）倒净上清液，倒置离心管于滤纸上1min，使残留的痕量作育液流尽。每管加1ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，冰浴30 min 。
（5）4℃，12000 rpm，2 min。
（6）倒净上清液，倒置离心管1min，使残留液流尽。每管加100 ul冰预冷的0.1 mol/L CaCl2重新悬浮细胞（重悬时操作要轻），即成感受态细胞悬浮液。
2.细菌转化：
（1）取3只灭菌的Ep管，划分编号1、2、3、划分加入以下各组分：加入10～20ng质粒DNA（体积小于10ul），同时做两个比照组：
1号：受体菌比照组： 100ul感受态细胞悬浮液+2ul无菌ddH2O
2号：质粒DNA比照组：100ul 0.1mol/L CaCl2+2ul pUC19
3号：正常转化组：100ul感受态细胞悬浮液+2ul pUC19
（2）轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min，增进DNA分子在感受态细胞外貌的吸附。
（3）转入42℃水浴2min，通过热刺激增强CaCL2的作用，使细胞膜爆发通道，便于DNA分子的吸附进入，提高转化率。
（4）迅速转入冰上冷却2min，修复细胞膜。
（5）加600u无抗生素lLB液体作育基，摇匀后于37℃，220 rpm，振荡60min。使受体菌恢复正常生长状态，并且表达Ampicillin抗性基因。
（6）取200ul菌液涂在含Ampicillin的LB平板，将平板置于无菌台直至液体被吸收，37℃恒温作育箱倒置作育12－16h后视察效果，其余生涯于4℃。若是平板上没有长出菌落，可将之置于37℃恒温作育箱继续作育，同时将剩下的500ul菌液离心，倒掉大部分上清，留100ul左右，用移液器奏乐重悬，再所有涂于含Ampicillin的LB平板上，置37℃作育。
（7）视察并纪录转化子泛起的数目，盘算转化率。
四、注重事项：
1. 实验中所用的器皿均要灭菌，以避免杂菌和外源DNA的污染。
2. 实验历程中要注重无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净事情台上举行。
3. 必需设比照组，以磨练实验历程中是否有污染。
4. 整个实验历程均需置于冰上。
5. 选用对数生恒久细胞，OD600不应高于0.6。
实验六 动物组织细胞基因组 DNA提取
一、实验原理
真核生物的一切有核细胞（包括作育细胞）都能用来制备基因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式保存于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与卵白质、脂类和糖类平疏散，又要坚持DNA分子的完整。提取DNA的一样平常历程是将疏散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和卵白酶K的溶液中消化剖析卵白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提疏散卵白质，获得的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
卵白酶K的主要特征是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）保存下坚持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应系统中，SDS可破损细胞膜、核膜，并使组织卵白与DNA疏散，EDTA则抑制细胞中Dnase的 活性 ；而卵白酶K可将 卵白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地疏散出来。
二、仪器及试剂
1. 仪器：
恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）
2. 试剂：
（1）细胞裂解缓冲液：
Tris (pH8.0) 100 mmol/L
EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L
NaCL 20 mmol/L
SDS 10%
胰RNA酶 20ug/ml
（2） 卵白酶K： 称取20mg卵白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。
（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。
（4）酚?氯仿?异戊醇（25:24:1）、
（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。
三、操作办法
1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），只管剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入卵白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。
2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以望见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新消融。（可举行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列办法举行）
3.加等量的酚?氯仿?异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。
4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。
5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。
6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的剩余液滴除掉。
7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。
8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的剩余液滴除掉，室温干燥。
9.加200ul TE重新消融沉淀物，然后置于4℃或?C20℃生涯备用。
10.吸收适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。
四、常见问题
1.选择的实验质料要新鲜，处置惩罚时间不易过长。
2.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必需匀称疏散，以镌汰DNA团块形成。
3. 提取的DNA不易消融：不纯，含杂质较多 ；加消融液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使消融变得很难题。
4. 电泳检测时DNA成涂布状：操作失慎 ；污染核酸酶等。
5.分光光度剖析DNA的A280/A260小于1.8 ；不纯，含有卵白质等杂质。在这种情形下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复办法2～8。
6.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸�。汉吲ǘ鹊�DNA，可加大抽提前缓冲液的量或镌汰所取组织的量。
实验七 DNA的定量
一、 实验原理
核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波优点有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特征为测定核酸溶液浓度提供了基础。
1 OD260相当于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml�？梢源死磁趟愫怂嵫返呐ǘ�。
紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）预计核酸的纯度，纯的DNA制品的比值为1.8，RNA的比值为2.0, 若DNA高于1.8,则可能有RNA污染，低于1.8则有卵白质污染。
关于很稀的核酸溶液，可用荧光光度法举行测定。DNA 自己并不爆发荧光，但在荧光染料溴化乙锭（EB）插入DNA 的碱基对平面之间并与之团结后，DNA样品能在紫外光的引发下爆发桔红色荧光。荧光强度与被团结的EB的量成正比，而被团结的EB的量又与核酸分子长度和含量成正比，使用一系列已知的差别浓度DNA溶液作标准比照，可较量出被测DNA溶液的浓度。迅速度可达1～5ng。由于是基于目测，以是是预计水平。 该要领经济轻盈，但准确性较低。
二、仪器及试剂
1. 仪器：Amersham GeneQantTM Pro 紫外可见分光光度仪，琼脂糖凝胶电泳装备。
2. 试剂及配制：
5×上样缓冲液：
配制10 ml
0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2 ml
10% SDS 50 ul
50% 甘油 2.5 ml
0.2% 溴酚蓝 10 mg
0.2% 二甲苯青FF 10 mg
加去离子水至10 ml
其它试剂：0.1×TE 、DNA标准液，EB贮存液（10 mg/ml），
三、实验办法
1.紫外分光光度法
（1）用0.1×TE看待测DNA样品按1:20或合适的倍数稀释。
（2）开机，仪器会自动对光路及剖析软件举行检测，待显示屏上泛起“instrument Ready”时，进入核酸测定窗口
（3）调零。先用0.1×TE缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“set ref”键，仪器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。
（4）吸70 ul已稀释的DNA样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。若是样品很少，可以用5～7ul的石英样品杯。点击“enter” 键，仪器即进入剖析状态。窗口同时显示260和280nm处的光密度（OD值）及260/280nm和280/260nm的比率以及DNA样品的浓度等。
（5）翻开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用高纯水清洁石英样品杯，风干后，再加入下一个待测样品。
（6）DNA纯度：以OD260/ OD280比值来反应。当OD60 /OD80比值 <1.8时，说明样品保存卵白质或酚等杂质，可接纳平衡酚/氯仿―异戊醇再抽提除去卵白质或用乙醚抽提去除残留酚，再用无水乙醇沉淀，TE悬浮后再测定。当OD60/OD280比值>2.0，说明样品保存RNA污染，可以用RNA酶处置惩罚样品行止RNA。
2. EB荧光剖析法
（1）琼脂糖凝胶的制备。
（2）样品的准备。把待测DNA样品举行1:2一连稀释，并准备一份DNA标准液作比照。
（3）上样。稀释样品与上样缓冲液按1:5混淆匀称后上样。
（4）电泳。用100V稳压电泳至溴酚蓝指示剂迁徙到凝胶的3/4处阻止电泳。
（5）取出凝胶，入EB荧光染液中作用20min，取出后清水漂洗清洁，然后紫外检测。肉眼可见到的最高稀释度约含DNA 80ng。此法也可用于相识核酸样品中的严重污染滋扰核酸紫外线吸收物质的情形。
四、常见问题
1． 紫外分光光度法不可区分DNA分子的构型，如质粒DNA分子的超螺旋、开环、线状三种构型，也不可区分染色体DNA和RNA等。由于测定吸收光度A260时，难以扫除RNA、染色体DNA、以及DNA解链的增色效应等因素的影响，因此测得的数据往往比现实浓度偏高。
2．OD320值是配景，若溶液盐浓度越高，OD320也越高。
3．测样品时使用的石英样品杯较量贵，要小心不要摔破，持杯时也不要接触透明的光面以阻止滋扰测定。
实验八 PCR基因扩增
一、实验原理
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的自然复制历程，是将在待扩增的DNA片断和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增 2n 倍。该手艺已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因剖析的必需工具。
PCR的事情程序现实上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等保存的情形下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。扩增的特异性取决于引物与模板DNA的团结。整个扩增历程分三步：①变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链 ；②退火，突然降低温度后模板DNA引物按碱基配对原则互补团结，也保存两条模板链之间的团结，但由于引物的高浓度、结构简朴等特点，主要的团结爆发在引物与模板之间 ；③延伸，在DNA聚合酶及镁离子等的保存条件下，从引物的 3 ′端最先，团结单核苷酸，形成与模板链互补的新的DNA链。完成以上三步为一个循环，每经由一个循环，样本中的DNA量就增添一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经由25～40个循环后，DNA 可扩增106～109倍。 现用图示说明PCR原理:
二、仪器及试剂
1.仪器：PCR仪、台式离心机、移液器及吸头、PCR薄壁管、电泳仪等
2.试剂：
10X PCR 缓冲液配制（部分随Taq酶提供）：
250～500 mmol/L KCl
100～500 mmol/L Tris-Cl（pH8.4）
15～20 mmol/L MgCl2
0.5% Tween-20
1mg/L BSA
其它试剂：模板DNA、dNTP 混淆液、Taq聚合酶、上游和下游寡核苷酸引物、琼脂糖凝胶、等
三、操作办法
1. PCR 系统（40ul）：
4ul 10XPCR 缓冲液
4ul 25mM MgCl2（凭证差别公司PCR 缓冲液的差别而定）
Xul 模板DNA ≥50ng
1ul 上游引物（50-100ng）
1ul 下游引物（50-100ng）
1ul dNTP Mixture（终浓度20－200uM）
0.4 ul Taq聚合酶
加ddH2O至40ul
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6000 rpm离心15 sec使反应因素集于管底。
3. PCR反应热循环程序设置：
（1） 95℃ 300s 变性
（2） 94℃ 45s 变性
（3） 55℃ 45s 退火（凭证差别引物可能有差别退火温度）
（4） 72℃ 45s 延伸（每分钟可延伸1kp）
重复办法2-4共 30 循环
（5） 72℃ 600s 延伸
反应竣事后短暂离心，吸收少量（10ul）举行剖析，其余置
4℃生涯备用。
4. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产品。
四、 注重事项：
1. PCR 系统所加因素的现适用量应凭证实验者选用的该因素的终浓度及所拥有的贮备液浓度举行核算。
2.加样时要认真,吸头笔直进入试剂管，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以避免错加或漏加，阻止污染。
3.Taq聚合酶（置于冰盒上）应最后加入，只管镌汰室温接触时机。加酶时吸头深入不可过深，酶量不可过多。
五 、影响PCR的主要因素
1.模板DNA
单链、双链DNA均可作为PCR的模板，DNA样品只管纯净，不可有核酸酶、卵白水解酶等的污染。模板用量依详细实验而定，一样平常为100ul反应液有105-106个目的分子。PCR反应时模板变性要充分。
2. PCR引物
PCR引物设计是否乐成是能否获得高质量PCR产品最要害的因素之一。在设计和应用时，需注重以下主要环节：
（1）PCR引物的长度约为18～30个核苷酸，并且成对引物间的G＋C含量应相似。以使它们在相近的温度下与其互补序列团结。G+C含量应为45%～55%之间。碱基漫衍是随机的，应阻止一连泛起4个以上的简单碱基，尤其是不应在其3，端泛起3个一连G或C，不然会使引物在G+C富集序列区过失引发。引物3，端碱基最好选用A、G、C,尽可能地阻止选用T ,尤其应阻止一连泛起2个以上T。
（2）一样平常来说，PCR产品≤500bp时，引物长度选择16-18bp ；PCR产品≥5kb时，引物长度选择24bp左右为宜。
（3）要阻止引物分子自身序列互补，不然会形成发夹样二级结构。两个PCR引物相互之间的3，最后序列不可有显着的互补性，以免形成引物二聚体。
（4）引物的熔点温度（Tm值）要适当。Tm值与引物的碱基组成和长度有关 ；PCR引物的GC/AT应与要扩增的模板DNA相当或略高些。一样平常熔点温度以大于55℃为宜。
（5）引物的3，最后必需与模板严酷互补，而5，最后的要求可无邪些。
（6）现在在引物选择中已普遍应用盘算机软件，从EMBL或Genebank中查找有关基因序列，并对设计的引物在引物二聚体形成、自身互补性及特异性等方面举行剖析评价。
（7）用于亚克隆的引物，常在引物的5，端加上限制性内切酶位点。为了包管内切酶有用酶切扩增产品，一样平常在酶切位点的5，端再加上几个特另外碱基。
（8）引物的浓度，在终浓度为0.2～1.0 umol/L的规模内产量基内情同，低于0.2 umol/L时会影响产量。但过高时一乃不经济，二则会泛起非特异扩增及增添引物二聚体的爆发。
3. 热稳固DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）
一样平常用量为2.5 U/100uL 反应体积。酶量过多易导致非特异性产品的爆发。该类酶的最适温度为75℃，在低温下仍保存相当高的活性，易引起不完全配对的引物-模板的非特异延伸及引物二聚体的扩增延伸，以是应注重避免非特异性产品的泛起。
4. dNTPs
PCR常用的dNTP浓度在50-200umol/L。四种dNTPs应等当量。浓度
低则反应速率下降，过高则特异性下降，可凭证详细实验来确定最适的dNTP浓度。
5. PCR缓冲液
因PCR反应中的dNTP能与Mg2+团结，影响反应液中游离Mg2+的浓度，以是应按差别条件，确定合适的Mg2+浓度。一样平常在标准的PCR反应中（dNTP浓度200umol/L），Mg2+浓度约为1.5mmol/L。Mg2+离子浓度可显著影响PCR的产量及产品特异性。浓度高则泛起非特异扩增，过低则酶活性显著下降。应用无核酸酶的BSA、Tween-20(0.05%～0.1%)及5mmol的二硫苏糖醇（DTT）对酶有一定的� ；ぷ饔�。
6. PCR循环的温度
预变性：起始变性的时间应该长些，以使变性充分。一样平常为94℃ 3-5min。变性不完全时，DNA双链会很快复性，影响PCR反应，但若变性温度太高（不宜凌驾95℃），会影响Taq酶的活性。
变性：一样平常为94℃ 30s或95℃ 20s。
引物退火：应凭证详细反应中引物与模板的碱基配对情形及实验的目简直定。一样平常为50-72℃。退火温度增高会增强对不准确退火引物的识别，还能降低引物3，端不准确核苷酸的过失延伸。
延伸：一样平常为72℃ 60-90s。最后一个循环后应在72℃保存5min，以包管PCR产品合成的完整性。
7． 平台效应和PCR循环的次数
在PCR基因扩增的后期，由于产品的群集，将使原来产品以指数增添的速率变为平展曲线，即所谓平台效应。它的泛起是由于PCR质料的一直消耗、酶的稳固性的降低、终产品的阻滞效应及非特异性产品等多种因素造成的，以是选择合理的循环次数，既能获得足够量的PCR产品，又不要无意义地增添循环次数。
8. 操作情形
阻止情形污染和交织污染，如核酸酶的污染、非目的DNA的污染等。
实验九 琼脂糖凝电泳疏散与纯化目的DNA
一、实验原理
疏散和纯化DNA酶切片断是基因工程中常用的手段。在电泳历程中差别巨细的片断疏散位于差别的位置，切下目的片断并接纳低熔点琼脂糖接纳法即可获得目的片断。有许多型号的低熔点琼脂糖可在65℃时熔化成液体，在30℃时凝固成凝胶。由于双链DNA的解链温度高于65℃，以是可以熔化凝胶而DNA并稳固性，在凝胶成液态时接纳DNA片断。该法的优点是可直接在熔化的凝胶中举行种种酶反应，如合成同位素探针、举行限制酶切割和毗连反应等。
二、仪器及试剂：
1.仪器
电泳仪、凝胶成像系统、移液器、离心管、吸头等。
2.试剂：
低熔点琼脂糖、待纯化的DNA、凝胶接纳试剂盒、去离子水或TE（pH7.6）。
三、操作办法：
1.配制1％的琼脂糖凝胶，在适当的位置切一条与加样槽平行的槽，换低熔点琼脂糖凝胶。
2.加样，100V电泳，视察所需片断是否移至低熔点胶内。
3.在紫外灯下切含有DNA的低熔点胶，置1.5 ml离心管中，于70℃热水中熔化。
4.按凝胶接纳试剂盒说明书操作。
12.取适量纯化好的目的DNA在 GeneQuant 中检测，确定纯度和浓度，其余样品于-20℃生涯。
四、 注重事项：
1. 配凝胶的三角瓶、电泳槽和配胶板要先冲洗清洁
实验十 DNA重组
一、实验原理
外源DNA与载体分子的毗连就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做重组子。DNA在体外的毗连重组是基因工程操作的焦点手艺之一，其实质是一个酶促反应历程。即在一定的条件下，DNA毗连酶催化两个双链DNA片断的5?端磷酸和3?端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的历程。常用的DNA毗连酶有两种：T4噬菌体DNA毗连酶和大肠杆菌DNA毗连酶。其中T4噬菌体DNA毗连酶对底物的要求低，能更有用地毗连DNA的平最后，应用更普遍。
T4噬菌体DNA毗连酶催化DNA毗连反应分3步：①首先，ATP与T4噬菌体DNA毗连酶通过ATP的磷酸与毗连酶的赖氨酸的氨基形成酶―ATP复合物。②被激活的AMP随后从赖氨酸残基转移到DNA一条链的5?端的磷酸基团上，形成磷酸―磷酸键。③DNA链3?端的羟基被活化，取代ATP后与DNA5?端的磷酸根形成磷酸二酯键，并释放出AMP，完成DNA之间的毗连。T4噬菌体DNA毗连酶需要镁离子和ATP作为辅助因子，在一定的温度和pH条件下举行毗连反应。
二、仪器及试剂：
1. 仪器：
台式离心机、移液器、吸头、恒温水浴锅等。
2. 试剂：
T4 DNA毗连酶、10×T4 DNA毗连酶缓冲液、 载体DNA、外源DNA。
三、操作办法
1. 外源DNA片断和载体DNA的毗连
取1只无菌Ep管、用微量进样器按下列顺序加入各因素。
10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul
酶切后的DNA片断 *1 约0.3 pmol
酶切后的载体DNA *2 约0.03pmol
T4 DNA Ligase 1ul
ddH2O 加至 25ul
*1 DNA片断的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3－10倍。
*2 相同最后的载体与DNA片断举行毗连时，应首先将载体举行去磷酸化处置惩罚，以避免其自身环化。
2.盖好盖子，用手指轻弹Ep管数次，并于台式离心机离心2s 以集中溶液。
3.将反应管放入16℃住宿反应（12～16h）。
4.取出约25ng的DNA毗连液举行琼脂糖凝胶电泳，判断毗连效果，以未经毗连的质粒DNA片断和酶切DNA片断作电泳。
5.用0.1×TE将毗连混淆物稀释至50ul，使用10～20ul转化大肠杆菌感受态细胞。
四、注重事项
1. 毗连产品经判断后应迅速做转化实验。
2. 凭证详细情形调理酶的用量。平端毗连或讨论毗连都比黏端毗连慢得多，并且酶的用量也增大。
3. 单价阳离子或低浓度的聚乙二醇可提高平端毗连的效率。
4. 避免载体DNA自身环化，常用碱性磷酸酶处置惩罚线性载体，去掉载体的5??C磷酸以抑制DNA片断的自身环化。
5. 准确调解载体DNA和外源DNA之间的比例有助于获得高产量的重组产品。
五、相关问题
1. 毗连反应的影响因素
除了载体、供体的浓度及其比例等因素外，影响毗连反应的因素尚有许多，如缓冲液组分、毗连温度与时间、酶浓度、DNA浓度及片断最后的碱基序列等。
（1）毗连缓冲液的影响
差别的公司提供的毗连缓冲液可能有所差别，但概略上都含有以下组分：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的规模在7.4-7.8，较多用7.8，目的是提供合适酸碱度的毗连系统 ；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应 ；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性情形，稳固酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增添卵白质的浓度，避免因卵白浓度过稀而造成酶的失活。与限制酶缓冲液差别的是毗连酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。
（2）pH的影响
一样平常将缓冲液的pH调理到7.4-7.8，较多用7.8。有实验批注，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么系统偏碱（pH为8.3）时仅为所有活力的65% ；当系统偏酸（PH为6.9）时仅为所有活力的40%。
（3）ATP浓度的影响
毗连缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L。研究发明，ATP的最适浓度为0.5-1mmol/L，过浓会抑制反应。例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平最后毗连，黏端的毗连也有10%被抑制 ；尚有报道，当ATP的浓度为0.1mmol/L时，去磷酸载体的自环比例最大。由于ATP极易剖析，以是当毗连反应失败时，除了DNA与酶的问题外，还应思量ATP的因素。含有ATP的缓冲液应于-20℃生涯，溶化取用后连忙放回。毗连缓冲液体积较大时最好分小管贮存，避免重复冻融引起ATP剖析。与限制酶缓冲液差别的是，含ATP的毗连缓冲液恒久安排后往往失效，以是也可自行配制不含ATP的缓冲液（可恒久生涯），临用时加入新配制的ATP母液。
（4）毗连温度与时间的影响
由于黏性最后的DNA双链间有氢键的作用，以是温度过高会使氢键不稳固，但毗连酶的最适温度又恰为37℃。为相识决这一矛盾，在经由综合思量后，古板上将毗连温度定为16℃，时间为4-16h。现经实验发明，关于一样平常的黏性最后来说，20℃ 30min就足以取得相当好的毗连效果，虽然若是时间充裕的话，20℃ 60min能使毗连反应举行得更完全一些。关于平最后是不必思量氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力获得更好的施展。
（5）酶浓度的影响
凭证New England Biolabs公司对T4 DNA毗连酶的界说，1U的酶可在16℃ 30min内毗连20ul系统中Hind Ⅲ酶切片断（黏性最后为0.12umol/L 5,最后，此时DNA质量浓度约为300ng/ul）的50%。一样平常使用的DNA浓度比酶单位界说状态低10-20倍，毗连平最后时酶用量要比毗连黏端大10-100倍，厂商为了知足这一要求，又往往提供高浓度的酶（几百个单位/ul），以是举行黏最后毗连时需先行稀释。除了连忙用于反应的部分可用酶反应缓冲液稀释外，其余都应使用厂商提供的稀释液。稀释液的因素与酶生涯缓冲液相同或类似，稀释液中的酶能在长时间坚持活力，也便于随时取用。
（6）DNA浓度的影响
只管有的实验手册上推荐使用0.1-1nmol/L的DNA浓度，但思量到用质粒作为载体克隆时，最后要求获得环化的有用毗连产品，以是DNA浓度不可过高，一样平常不会凌驾20nmol/L。相较量而言，以噬菌体、cosmid质粒为载体的克隆历程最后要求线性化的毗连产品，以是，DNA的浓度可以高些，至少是靠近推荐的浓度。别的，在用大质粒载体举行大片断克隆时，以及在双酶切片断的毗连反应中，DNA浓度还应降低，甚至是DNA的总浓度低至几个nmol/L。另据研究，T4 DNA毗连酶对DNA最后的表观Km值为1.5nmol/L，以是，毗连时DNA浓度不应低于1nmol/L。即应具有2nmol/L的最后浓度。
2. 三种毗连酶单位界说
（1）Weiss单位
毗连酶单位最早是1968年由Weiss提出的Weiss单位，现也称PPi单位。他的单位界说为：37℃ 20min内将1nmol的32P从焦磷酸根上置换到ATP分子上所需的酶量。现在大大都厂商仍使用这种单位。
（2）d（A-T）环化单位
由于Weiss单位界说中测试的是T4 DNA毗连酶中除毗连功效外的另一种磷交流功效，并且测试温度高达30℃，与现实毗连反应相比无论在哪一方面都有一定的差别，于是，1970年Modrich与Lehman提出了真正怀抱毗连功效的d(A-T)环化单位，又称外切酶抗性检测。d（A-T）环化单位的界说为：30℃ 30min 内将100nmol/L的d（A-T）（约2kb长）转化成抗外切酶的形式。
（3）黏性最后单位
与Weiss单位相比，d（A-T）环化单位更靠近现实，但仍有一定的问题，例如，环化单位测试中用的是纯AT片断，与现实毗连中4种碱基随机排列不符 ；再说，若是毗连酶将片断毗连成多聚体而末环化时，仍可能被外切酶组所切 ；除此之外，与现实上大大都毗连反应使用的温度16℃相比，30℃仍显得偏高。为了权衡现实毗连条件下的酶活力，New England Biolabs公司提出了最适用的黏性最后单位，它的单位界说为：16℃ 30min内将5,最后浓度为0.12umol/Lλ-HindⅢ 酶切片断的50%毗连上。
实验十一 动物组织细胞总RNA的提取
一、实验原理
RNA是基因表达的中心产品，保存于细胞质与核中。对RNA举行操作在分子生物学中占有主要职位� ；竦酶叽慷群屯暾�RNA 是许多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很洪流平上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部分RNA是以核卵白复合体的形式保存，以是在提取RNA时要使用高浓度的卵白质变性剂，迅速破损细胞结构，使核卵白与RNA疏散，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处置惩罚、离心，使RNA与其他细胞组分疏散，获得纯化的总RNA。在提取的历程中要抑制内源和外源的RNase活性，� ；�RNA分子不被降解。因此提取必需在无RNase的情形中举行�？墒褂�RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源RNase活性。提取缓冲液中一样平常含SDS、酚、氯仿、胍盐等卵白质变性剂，也能抑制RNase活性。并有助于除去非核酸因素。
本实验介绍异硫氰酸胍法和TRIzol法提取动物组织总RNA并通过电泳 举行判断。
二、仪器和试剂
1.仪器：
超净事情台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管、
玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h ；不耐高温的器皿（如塑料制品）应用0.1% DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高压20min，再70～80℃烘烤干燥方可使用。
2.试剂：
(1)细胞裂解液：
异硫氰酸胍 4mol/L
柠檬酸钠（pH7.0） 25mmol/L
十二烷基肌氨酸钠 0.5%
β-巯基乙醇 0.1mol/L
称取柠檬酸钠0.64g，十二烷基肌氨酸钠0.415g，吸收β-巯基乙醇0.7ml，用无Rnase的蒸馏水消融，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，异硫氰酸胍 25g,混淆，完全消融后4℃生涯备用。
(2)10×凝胶缓冲液：
吗啉代丙璜酸（MOPS）（pH7.0） 200mmol/L
NaAc 100mmol/L
EDTA(pH 8.0) 10mmol/L
过滤除菌后避光生涯。
（3）5×变性上样缓冲液：
水饱和的溴酚蓝 16μl
500mmol/LEDTA(pH 8.0) 80μl
甲醛（37%） 720μl
甘油 2ml
甲酰胺 3084μl
10×凝胶缓冲液 4ml
加无RNase水至10ml，4℃可生涯3个月。
（4）TRIzol RNA抽提试剂
（5）2mol醋酸钠
（6）0.1% DEPC
(7)平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）
（8）平衡酚、氯仿
（9）无水乙醇、70%乙醇、异丙醇
(10)无RNase水
三、操作办法
（一）异硫氰酸胍法（PLT）
1.取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的细胞裂解液1ml,在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一试管中。
2.加入2mol醋酸钠（pH4.0）120μl，充分混匀。
3.加入1.2ml酚：氯仿：异戊醇，充分混匀摇振10s，冰浴15min。
4.将混淆物转移至1.5ml Ep管中，4℃，离心10 000r/min,20min.
5.移取上层水相至另一Ep管中，加入等体积的异丙醇，静置?C20℃，30min沉淀RNA.
6. 4℃，离心12 000r/min，15min.
7. 弃上清液，加入70%乙醇400μl,洗涤RNA沉淀物 ；若是RNA沉淀物被悬浮，则4℃离心10 000r/min，10min。
8. 弃上清液，自然干燥，但应阻止沉淀完全干燥，不然RNA难以消融。
9.加入100μl无RNase水重悬RNA，或加1ml无水乙醇和1/10体积3mol醋酸钠（pH4.0），?C70℃生涯。
（二）TRIzol试剂提取RNA
1.取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的Trizol液 1ml 于玻璃匀浆器中，在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一1.5ml Ep管中，于室温下静置5min。
2.加入200μl氯仿，强烈振摇15s混匀后，室温静置3min。
3. 4℃，10 000r/min离心15min，RNA漫衍于水相中。
4.将上层无色水相转移到另一Ep管中，加入500μl 异丙醇，室温静置10min。
5.4℃，10 000r/min离心10min。
6.弃上清液，用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀物，4℃，7500r/min离心5min。
7.弃上清液，室温干燥15min.
8.向干燥过的沉淀物中加入200μl DEPC处置惩罚水（无核水）消融沉淀物，于-20℃生涯备用。
（三）RNA检测
1.在紫外分光光度计上检测RNA浓度及纯度。
要领同实验四，用DEPC处置惩罚水校正零点 ；用DEPC处置惩罚水稀释RNA样品 ；读取OD260、OD280值及OD260/OD280的比值。
2. 琼脂糖凝胶甲醛变性电泳检测
（1）制备凝胶（1.2%）。称1.2g琼脂糖，加72ml DEPC处置惩罚水，加热熔化。冷却至60℃，在透风橱内加入10×凝胶缓冲液10ml，甲醛（37%）18ml，混匀后，倒胶。
（2）制备样品。在离心管中，将RNA样品与5×变性上样缓冲液以4：1混匀。65℃温育5～10min，迅速在冰上冷却5min，离心数秒。
（3）上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品卷入上样孔。以5V/cm的电压电泳1.5～2h.。
（4）待溴酚蓝迁徙至凝胶长度的2/3～4/5处竣事电泳。将凝胶置于溴化乙啶溶液（0.5μg/ml，用0.1mol/L乙酸胺配制）中染色约30min。
（5）在凝胶成像系统视察并剖析。
四、注重事项
1.RNA是极易降解的核酸分子。因此提取总RNA必需在无RNase 情形中，戴口罩、手套、使用无RNase污染的试剂、质料、容器。
2.所有溶液应加DEPC至0.05%～0.1%，室温处置惩罚住宿，然后高压处置惩罚或加热至70℃ 1 小时或60℃住宿，以除去石油残留的DEPC。
3.所用的化学试剂应为新包装，称量时使用干烤处置惩罚的称量勺，所有操作均应在冰浴中举行，低温条件可减低RNA酶活性。
4.凭证RNA样品的紫外吸收OD值，可盘算出RNAd 浓度。
单链RNA [ssRNA]=40×（OD260-OD310）×稀释倍数
纯RNA OD260 / OD280比值通常在1.7～2.0。若比值低于1.7,说明有卵白质等污染，应用酚/氯仿在抽提。若比值低于2.0,批注有盐、胍、糖可用LiCL选择沉淀RNA以除去杂质。
5.RNA样品电泳后，可见28S、18S及5S小分子RNA条带，则说明完整性好。若有降解可能是操作不当或污染了RNase.。28S和18S RNA比值约为2：1,批注RNA无降解。如比值逆转，则批注RNA降解。电泳中若是在28S 后方尚有条带，批注有DNA污染，应用DNase处置惩罚后再举行纯化。
主要参考书：
1..金冬雁等译.分子克隆实验指南. 第二版.北京：科学出书社，1995
2.子颖等译.精编分子生物学实验指南. 科学出书，
3.周俊宜编.分子生物学基本手艺和战略. 科学出书社
4.姜泊等编.分子生物学常用实验要领.北京：人民军医出书社，1996.
5.刘进元等编.分子生物学实验指导.北京：清华大学出书社，2002.
